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Nature Communications volume 13, numero articolo: 4337 (2022) Citare questo articolo

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Riportiamo un candidato vaccino SARS-CoV-2 vivo attenuato con (i) sequenze di regolatori della trascrizione virale riprogettate e (ii) frame di lettura aperti (ORF) cancellati 3, 6, 7 e 8 (∆3678). Il virus ∆3678 si replica circa 7.500 volte meno del SARS-CoV-2 wild-type su colture primarie di vie aeree umane, ma ripristina la sua replicazione su cellule Vero-E6 carenti di interferone approvate per la produzione di vaccini. Il virus ∆3678 è altamente attenuato sia nei modelli di criceto che di topo K18-hACE2. Un’immunizzazione a dose singola del virus ∆3678 protegge i criceti dall’esposizione e dalla trasmissione del virus di tipo selvatico. Tra gli ORF cancellati nel virus ∆3678, ORF3a rappresenta la maggiore attenuazione attraverso l'antagonizzazione della fosforilazione di STAT1 durante la segnalazione dell'interferone di tipo I. Abbiamo anche sviluppato un virus reporter mNeonGreen ∆3678 per la neutralizzazione ad alto rendimento e i test antivirali. Nel complesso, i risultati suggeriscono che ∆3678 SARS-CoV-2 può fungere da candidato vaccino vivo attenuato e da strumento di ricerca per un potenziale utilizzo di livello 2 di biosicurezza.

La pandemia di COVID-19, causata da SARS-CoV-2, ha portato a oltre 513 milioni di infezioni confermate e 6,2 milioni di decessi (al 1 maggio 2022; https://coronavirus.jhu.edu/). Sono state sviluppate con successo diverse piattaforme di vaccini per il COVID-19, tra cui mRNA, vettore virale, proteina a subunità e virus inattivato. I vaccini vivi attenuati del SARS-CoV-2 non sono stati esplorati attivamente, anche se potrebbero presentare i vantaggi di basso costo, forte immunogenicità e durata immunitaria potenzialmente lunga1. Il virione SARS-CoV-2 è costituito da un nucleocapside interno, formato dall’RNA genomico rivestito con proteine ​​del nucleocapside (N), e da un involucro esterno, formato da una membrana bilipidica di derivazione cellulare incorporata con punta (S), membrana (M) e proteine ​​dell'involucro (E)2. Il genoma di RNA virale a singolo filamento con senso positivo codifica fotogrammi di lettura aperti (ORF) per sedici proteine ​​non strutturali che formano il meccanismo di replicazione (ORF1a/ORF1b), quattro proteine ​​strutturali (S, E, M e N) e sette proteine ​​accessorie3. Sebbene le funzioni esatte delle proteine ​​accessorie del SARS-CoV-2 restino da determinare, studi precedenti su altri coronavirus suggeriscono che queste proteine ​​non sono essenziali per la replicazione virale ma possono modulare la replicazione e la patogenesi interagendo con le vie dell’ospite4,5,6,7, 8. Pertanto, l’eliminazione delle proteine ​​accessorie potrebbe essere utilizzata per attenuare SARS-CoV-2.

I coronavirus replicano e trascrivono gli RNA subgenomici (sgRNA) attraverso un meccanismo di trascrizione discontinuo mediato da sequenze regolatrici della trascrizione (TRS). I TRS sono sequenze nucleotidiche conservate che si trovano vicino all'estremità 5' del genoma e alle estremità 5' degli ORF a valle (Fig. 1a). Questi TRS regolano la trascrizione tramite accoppiamento di basi tra il TRS leader e i TRS del corpo che porta alla produzione di sgRNA, che traducono gli ORF a valle9,10,11. All'interno del TRS, una sequenza centrale composta da 6 a 8 nucleotidi guida la formazione della coppia di basi tra l'RNA nascente e il TRS leader. È stato precedentemente dimostrato che ricablare la sequenza guida della rete TRS SARS-CoV potrebbe produrre un virus attenuato. Tale SARS-CoV mutante TRS potrebbe fungere da approccio vaccinale vivo attenuato per ridurre al minimo il rischio di reversione12,13.

un diagramma di schema per la costruzione di Δ678 e Δ3678 SARS-CoV-2. Le delezioni sono state introdotte nella struttura portante del ceppo USA-WA1/2020. Le caselle verdi e rosse indicano rispettivamente le sequenze TRS originali e mutate. T7 Promotore T7, sequenza L leader, sequenze regolatrici della trascrizione TRS; Cornice a lettura aperta ORF, gene della glicoproteina dell'involucro E, gene della glicoproteina di membrana M, gene del nucleocapside N, regione non tradotta UTR, code di poli A pA. b Morfologie delle placche dei virus ricombinanti WT, Δ678 e Δ3678. I test della placca sono stati eseguiti su cellule Vero-E6 e colorati il ​​giorno 2,5 dopo l'infezione. c–e Cinetica di replica di SARS-CoV-2 WT, Δ678 e Δ3678 su cellule Vero-E6 (c), Calu-3 (d) e HAE (e). I virus WT, Δ678 e Δ3678 sono stati inoculati su cellule Vero-E6, Calu-3 e HAE a MOI di 0,01, 0,1 e 2, rispettivamente. Dopo un'incubazione di 2 ore, le cellule sono state lavate tre volte con DPBS e coltivate in continuo sotto DMEM FBS fresco al 2%. I surnatanti delle colture sono stati misurati per i titoli dei virus infettivi utilizzando test di placca su cellule Vero-E6. f Livelli intracellulari di RNA WT, Δ678 e Δ3678 nelle cellule HAE il giorno 7 dopo l'infezione. Le cellule HAE sono state lavate con PDBS per tre volte, lisate con Trizol per l'isolamento dell'RNA, quantificate per gli RNA virali utilizzando RT-qPCR. c–f I punti rappresentano le singole repliche biologiche (n = 3 per Vero-E6 e Calu-3; n = 5 per HAE). I valori nel grafico rappresentano la media ± deviazione standard. È stato utilizzato un test t a due code non accoppiato per determinare differenze significative tra i gruppi WT e Δ678/Δ3678. I valori P sono stati aggiustati utilizzando la correzione Bonferroni per tenere conto di confronti multipli. Le differenze sono state considerate significative se p < 0,025. g di cellule HAE mNG-positive dopo l'infezione con il virus mNG WT o mNG Δ3678 a un MOI di 0,5. Vengono mostrate immagini rappresentative di cellule mNG-positive da tre esperimenti indipendenti; la bassa risoluzione delle immagini mNG-positive era dovuta al fatto che la coltura HAE era costituita da cellule vive multistrato su un inserto di plastica, posizionato in piastre a 6 pozzetti. Barra della scala, 100 µm. c–f I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine.